تهینه سازی تولید و استخراج آنزیم لیپاز از سویه آسپرژیلوس نایجر با استفاده از ضایعات میوه خرما و تثبیت آن جهت کاربرد در صنایع غذایی

در بین آنزیم ها، لیپازها گروه مهمی با کاربردهای گسترده در صنایع مختلف را تشکیل می دهند، لیپاز حاصل از کپک aspergillus niger به دلیل ایمنی تولیدات آن در صنایع غذایی و دارویی از اهمیت زیادی برخوردار است. جهت غربالگری بهترین سویه تولید کننده لیپاز از میان 3 سویه a.niger، از روش پلیت آگار روغن زیتون/رودامین b و همچنین ارزیابی مستقیم محلول آنزیمی استفاده شد. سپس بهترین سویه برای تولید لیپاز با استفاده از کشت غوطه وری در محیط حاوی شیره خرما مورد بررسی قرار گرفت. تولید آنزیم تحت تاثیر شرایط مختلف محیطی متغییر است، لذا در این تحقیق ابتدا ترکیبات محیط کشت شامل منبع کربن، منبع پروتئین و محرک آنزیمی با استفاده از طرح باکس-بنکهن و در مرحله بعد دو پارامتر میزان ph و سرعت همزدن در تولید لیپاز توسط a.niger با استفاده از طرح سنترال کامپوزیت به روش سطح پاسخ (rsm) مورد بررسی قرار گرفت. بهینه سازی ترکیبات محیط کشت نشان دهنده معنی دار بودن مدل درجه دوم با ارزش p 0003/0 و 96/0=r2 می باشد. بیشترین میزان لیپاز تولیدی در محیط کشت حاوی 74/2% شیره خرما، 06/1% ترکیب عصاره مخمر و پپتون 06/2% روغن زیتون بدست آمد. 5/7=ph و سرعت همزدن rpm 190 بهترین نتیجه را در تولید لیپاز به صورت کشت غوطه وری در محیط حاوی شیره خرما، نشان دادند. نتیجه آنالیز واریانس بهینه سازی شرایط کشت بیانگر معنی دار بودن مدل درجه دوم با ارزش p 0001/0> و 97/0=r2 می باشد. راندمان تولید لیپاز پس از بهینه سازی ترکیبات و شرایط محیط کشت بر حسب واحد آنزیم تولیدی به ازای یک لیتر محیط کشت برابر با u 11420 بود. همچنین راندمان تولید لیپاز توسط شیره خرما پس از بهینه سازی نیز برابر با 78/416 واحد به ازای هر گرم شیره خرمای مصرفی بود. بیشترین تولید آنزیم در 102 ساعت پس از کشت مشاهده شد. میزان فعالیت و پایداری آنزیم در ph های مختلف و همچنین در دماهای مختلف، مورد بررسی قرار گرفت و بیشترین فعالیت آنزیم در 7=ph مشاهده شد در حالیکه آنزیم در شرایط اسیدی پایدار می باشد. فعالیت لیپاز در دمای 30 درجه سانتی گراد بهینه بود و پایداری آن با افزایش دما کاهش می یابد. لیپاز حاصل از a.niger ، پس از استخراج از محیط کشت توسط رسوب دهی با درصد های متفاوت حلال استون و روش کروماتوگرافی تعویض یونی با استفاده از sp-sepharose hp و q-sepharose hp خالص سازی شد. جهت بررسی روند خالص سازی از الکتروفورز و جهت ردیابی آنزیم و تعیین وزن مولکولی آن از روش زایموگرافی با استفاده از پوشاننده حاوی فنول رد و ردامین b، استفاده شد. نتایج نشان داد بخش اعظم آنزیم لیپاز آسپرژیلوس نایجر، بوسیله استون 70% اشباع رسوب می کند که این امر باعث تخلیص آنزیم به میزان 67/1برابر، با فعالیت ویژهu/mg 8/32 و بازده 5/38% می شود. با استفاده از دو مرحله کروماتوگرافی آنزیم با فعالیت ویژهu/mg 47/246 و 59/12برابر تخلیص بدست آمد. نتایج الکتروفورز و زایموگرافی نشان دهنده باند لیپاز با وزن حدود 30 کیلو دالتون می باشد. اثر غلظت کیتوزان، غلظت تری پلی فسفات و میزان آنزیم لیپاز حاصل از a.niger پس از رسوب دادن با استون 70%، به عنوان آنزیم مدل جهت تثبیت با روش پاسخ سطح و طرح سنترال کامپوزیت مورد بررسی قرار گرفت. نتیجه بدست آمده نشاندهنده معنی دار بودن مدل درجه دوم و شرایط بهینه بدست آمده 8/54% تثبیت وu/g 63/12 فعالیت لیپاز در 17/2% کیتوزان، m 135/0 stpp و mg 16/2 آنزیم می باشد.